Coole Technik

Einfrieren unter dem Lichtmikroskop

18.06.2019

Professor Thomas Burg friert lebende Zellen und Organismen ohne Zeitverzögerung unter dem Lichtmikroskop ein. Sein Ziel: eine bessere Verbindung von Licht- und Elektronenmikroskopie.

In den Laboren des Fachgebiets Integrierte Mikro-Nano-Systeme verbinden Professor Thomas Burg und sein Team Methoden der Mikrosystemtechnik, Biolgie und Chemie.

Der Physiker liebt Extreme. Seine Untersuchungsobjekte sind extrem klein, extrem kalt und extrem schwierig darzustellen. Thomas Burg ist seit einigen Monaten Professor am Fachbereich Elektrotechnik und Informationstechnik der TU Darmstadt und leitet das Fachgebiet „Integrierte Mikro-Nano-Systeme“. Er will die Untersuchung zellulärer Prozesse entscheidend voranbringen, denn das Leben ist nicht statisch, sondern dynamisch. Dafür müssen Licht- und Elektronenmikroskopie allerdings noch besser ineinandergreifen als bisher, damit die Vorteile beider Verfahren ohne jede Zeitverzögerung zum Tragen kommen. Dem Europäischen Forschungsrat ERC ist Burgs Forschung in den kommenden fünf Jahren rund zwei Millionen Euro wert.

Die Lichtmikroskopie untersucht lebende Zellen und Organismen. Dabei können bestimmte Moleküle gezielt mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und hervorgehoben werden. Allerdings ist die Auflösung der herkömmlichen Fluoreszenz-Lichtmikroskope aufgrund der Wellennatur des Lichts auf etwa 200 Nanometer begrenzt. Zwar kann man seit kurzem mit einem Trick auch höhere Auflösungen erreichen, aber eine detaillierte Strukturaufklärung im Bereich von 0,1 bis 10 Nanometern ist derzeit nur mit der Elektronenmikroskopie möglich. Dafür müssen die Zellen und Organismen fixiert werden. Ganz ohne Schaden gelingt dies nur mit der Kryofixierung. Bei diesem Verfahren werden die Proben blitzschnell auf Temperaturen unter -135oCelsius gekühlt. Nur so behält das Wasser seine glasartige, ungeordnete Struktur. Die zellulären Strukturen bleiben wegen der ausbleibenden Eisbildung dabei weitestgehend erhalten.

Transferschritt sorgt für Verzögerung

„Wer dynamische Vorgänge beobachten will, hat allerdings ein Problem“, sagt Burg, der vor seinem Wechsel an die TU Darmstadt zehn Jahre lang eine Nachwuchsgruppe am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen geleitet hat. „Die im Lichtmikroskop betrachteten Proben müssen für die Kryofixierung umgelagert werden. Es gibt also einen Transferschritt. Der manuelle Transfer dauert manchmal Minuten, je nachdem wie schnell jemand arbeitet. Der automatisierte Transfer dauert ein bis fünf Sekunden. Es bleibt also immer eine zeitliche Lücke zwischen dem letzten Blick auf den dynamischen Prozess im lebenden Objekt unter dem Lichtmikroskop und dem schockgefrorenen Zustand im kryofixierten Objekt. Es fehlt also immer ein Stück der Reaktionskette.“

Burg will die Zellen und Organismen daher direkt unter dem Lichtmikroskop einfrieren, um sie dann im schockgefrorenen Zustand mit der Licht- und Elektronenmikroskopie zu untersuchen. Dafür muss die Wärme blitzschnell entzogen und die Probe zur weiteren Untersuchung ununterbrochen auf unter -135oCelsius gekühlt werden, damit sich die Wassermoleküle nicht doch langsam zu Eiskristallen zusammenfinden und die empfindliche Struktur zerstören.

Blitzschnelles Einfrieren ohne Zwischenschritt

Burg hat eine wichtige Hürde auf diesem Weg genommen. Für das Einfrieren unter dem Lichtmikroskop verwendet er Bauelemente aus der Mikrosystemtechnik. Dazu gehört ein elektrisch beheizter Mikrokanal, in dem die Zellen oder Organismen zunächst bei physiologischen Temperaturen beobachtet werden können. Ein unter dem Mikrokanal liegendes Heizelement hat Kontakt zu einem Silizium-Chip, der mit Flüssigstickstoff gekühlt wird. Wenn das Heizelement ausgeschaltet wird, wird die Temperatur blitzschnell über diesen Silizium-Chip abgeleitet. Gleichzeitig friert auch die Probe blitzschnell ein. Dieser Aufbau gibt dem Betrachter die Gelegenheit, die zellulären Prozesse bis zu dem Punkt zu studieren, an dem das Heizelement ausgeschaltet wird und das Temperaturgefälle zwischen Untersuchungsobjekt und Umgebung schlagartig kollabiert und die Proben innerhalb von Millisekunden einfrieren.Anschließend kann das gefrorene Objekt nach entsprechender Vorbereitung auch im Elektronenmikroskop untersucht werden.

„Durch die Eliminierung des Transferschritts verbessern wir die Koppelung zwischen Licht- und Elektronenmikroskopie“, sagt Burg. „Aber wir wollen mehr. Wir wollen die kryofixierten Proben auch direkt unter dem Lichtmikroskop betrachten.“ Diese sogenannte Kryo-Lichtmikroskopie steckt allerdings noch in den Kinderschuhen. Eine Herausforderung ist das unvermeidbare Temperaturgefälle zwischen dem Mikroskop bei Raumtemperatur und der auf -140 Celsius gekühlten Probe. Für die bestmögliche Auflösung muss der Luftspalt zwischen dem Mikroskopobjektiv und der Probe auch mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt werden. Dabei dürfen die empfindlichen Linsen des Objektivs durch die tiefe Temperatur keinen Schaden nehmen, und es darf auch keine zu große Wärme über die Frontlinse in die Probe gelangen. Außerdem brauchen Burg und seine Kollegen eine Immersionsflüssigkeit, die bei dieser tiefen Temperatur den gleichen Brechungsindex hat wie Wasser bei Raumtemperatur.

Ziel: unbeschadet einfrieren und wieder auftauen

Der Physiker und seine Kollegen haben das erste Problem gelöst, indem sie die sehr kleine Frontlinse eines hochwertigen Immersionsobjektivs kühlen und sie über eine geschickt beheizte Keramikfassung vom Mikroskop abschirmen. Dadurch werden Frontlinse und Probe wie durch eine Tarnkappe vor den größeren und em findlicheren Linsen des Mikroskops versteckt. Burg und sein Team haben auch eine geeignete Immersionsflüssigkeit entdeckt. Sie trägt den Namen Ethoxynonafluorbutan. „Es war nicht einfach, etwas Geeignetes zu finden“, sagt Burg. Es gibt nur sehr wenig Information über den Brechungsindex von Flüssigkeiten bei diesen tiefen Temperaturen. Man findet Angaben bis zu -80oCelsius, aber nicht tiefer. Wir mussten also sehr viel ausprobieren“. Burg erreicht mit seinem Set-up zur Kryo-Lichtmikroskopie derzeit eine Auflösung von 350 Nanometern. Als nächstes wollen er und sein Team das Verfahren weiter verbessern, es routinetauglicher machen und in Verbindung mit sogenannten Superresolution-Verfahren nutzen, die mit derselben Optik eine bis zu 10-fach höhere Auflösung möglich machen.

Burg will mit der finanziellen Unterstützung des Europäischen Forschungsrates auch prüfen, ob Zellen ohne Schaden wieder aufgetaut werden können. „Am besten wäre es, wenn sich die Zellen nach dem Auftauen gar nicht mehr an das Einfrieren erinnern würden, sondern ihre zellulären Aktivitäten einfach dort wieder aufnehmen würden, wo sie durch das Einfrieren zum Stillstand gekommen sind.“ Burg weiß, dass dies noch ferne Zukunftsmusik ist, aber er kennt die Probleme, die zu lösen sind. Man braucht zum Beispiel extrem hohe Kühlraten und muss die Zellen und Organismen mit sehr wenig oder gänzlich ohne Frostschutzmittel eingefrieren. Aber auch bessere Frostschutzmittel wären wünschenswert. Vielleicht gelingt es Burg am Ende, die Zellen unter dem Lichtmikroskop ständig unbeschadet einzufrieren und wieder aufzutauen. Dann könnten dynamische Prozesse nach Belieben betrachtet, angehalten und wieder angestoßen werden. Bis dahin ist es allerdings noch ein weiter Weg.

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